阪崎腸桿菌（Enterobactersakazaii）是奶粉（乳）制品中新發(fā)現(xiàn)的一種致病菌。由其引發(fā)的嬰兒、早產(chǎn)兒腦膜炎、敗血癥及壞死性結(jié)腸炎散發(fā)和暴發(fā)的病例已在全球相繼出現(xiàn)。本公司自主研制的阪崎腸桿菌活菌熒光PCR檢測試劑盒能快速檢測出奶粉（乳）制品中存在的阪崎腸桿菌菌屬，且相比DNA-PCR的檢測方法，本檢測方法可以區(qū)分死菌和活菌，因此不需要進行再次驗證。 本試劑盒通過實時熒光RT-PCR反應(yīng)對奶粉（乳）制品中的阪崎腸桿菌進行定性檢測，靈敏度高，特異性強， 能快速檢測出奶粉（乳）制品中的阪崎腸桿菌。

產(chǎn)品規(guī)格

 40次/盒

主要成分

儲存條件

 本試劑盒保存于-20℃，有效期12 個月。

檢測步驟

1.樣本處理

取100g(ml)樣品，加入900ml的無菌蒸餾水，震蕩溶解，與 37度培養(yǎng)15h左右。移取1ml 轉(zhuǎn)入 10ml改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯中，37度震蕩培養(yǎng)約6h 。

2.樣本RNA提取

取1.5ml增菌液，采用商品化的細(xì)菌RNA提取試劑盒，按照試劑盒說明提取樣本 RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA 待用。

3.試劑準(zhǔn)備

冰上解凍反應(yīng)試劑，反應(yīng)液保持避光，解凍后將反應(yīng)液混勻并簡短離心，按每管15ul的量分裝至PCR管中。

4.PCR加樣

每管中加入cDNA樣本10ul，蓋好管蓋，簡短離心，同時做陽性對照，陰性對照和空白對照（以水代替樣本 cDNA）。

5.PCR擴增

將加好的樣品放置在PCR儀中，熒光通道選擇FAM， PCR反應(yīng)參數(shù)見表，使用不同的PCR儀，反應(yīng)參數(shù)可適當(dāng)調(diào)整。

6.結(jié)果分析

基線和閾值的設(shè)置：基線范圍設(shè)置在3-15個循環(huán)，閾值設(shè)置在基線剛好超過陰性對照擴增曲線的最高點。

質(zhì)量控制：陽性對照CT≤30，有S 型擴增曲線；陰性對照無CT值，擴增曲線為直線；空白對照無CT值，擴增曲線為直線。若出現(xiàn)任一結(jié)果不正常，需重做實驗。

結(jié)果判定

1.檢測樣品無CT值，曲線為直線或無S 型擴增曲線，判定結(jié)果為陰性。

2.檢測樣品CT≤35，出現(xiàn)S型擴增曲線，判定結(jié)果為陽性。

3.檢測樣品35﹤CT﹤40并有S型擴增曲線，需適當(dāng)增加DNA模板量后重新做實時熒光PCR檢測，再次檢測結(jié)果CT值仍處于35和40之間，并且有S型擴增曲線，判定結(jié)果為陽性，否則判定為陰性。

最低檢測限

8cfu/100g(ml)

注意事項

1.初次使用前請仔細(xì)閱讀說明書，并嚴(yán)格按照說明書進行操作。

2.實驗操作要嚴(yán)格分區(qū)，防止污染。

3.RNA提取時要使用無RNA酶的槍頭和管子，防止RNA降解。

4.反應(yīng)液反復(fù)凍融會降低靈敏度，建議分管保存。

5.本試劑盒僅供定性篩查用。